Nature volume 618, páginas 118–125 (2023)Cite este artigo
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O voo assíncrono dos insetos é uma das formas mais prevalentes de locomoção animal usada por mais de 600.000 espécies. Apesar dos insights profundos sobre os padrões motores1, a biomecânica2,3 e a aerodinâmica subjacentes ao voo assíncrono4,5, a arquitetura e a função da rede neural geradora de padrões centrais (CPG) permanecem obscuras. Aqui, com base em uma abordagem experimental-teórica incluindo eletrofisiologia, optofisiologia, genética de Drosophila e modelagem matemática, identificamos uma solução de circuito miniaturizado com propriedades inesperadas. A rede CPG consiste em motoneurônios interconectados por sinapses elétricas que, em contraste com a doutrina, produzem atividade de rede espalhada no tempo, em vez de sincronizada entre os neurônios. Evidências experimentais e matemáticas apoiam um mecanismo genérico para dessincronização de redes que depende de sinapses elétricas fracas e dinâmicas de excitabilidade específicas dos neurônios acoplados. Em redes pequenas, as sinapses elétricas podem sincronizar ou dessincronizar a atividade da rede, dependendo da dinâmica intrínseca do neurônio e da composição do canal iônico. No CPG de voo assíncrono, esse mecanismo traduz a entrada pré-motora não padronizada em disparos neuronais estereotipados com sequências fixas de ativação celular que garantem uma potência estável de batida de asas e, como mostramos, é conservada em múltiplas espécies. Nossas descobertas comprovam uma versatilidade funcional mais ampla das sinapses elétricas no controle dinâmico de circuitos neurais e destacam a relevância da detecção de sinapses elétricas na conectômica.
Com mais de um milhão de espécies conhecidas, os insetos constituem o maior grupo de animais da Terra6. Seu considerável sucesso evolutivo foi atribuído ao pequeno tamanho corporal e à capacidade de voar. Estas duas características proporcionam acesso a nichos não utilizados e rápida translocação, mas as restrições aerodinâmicas em pequenos voadores requerem altas frequências de batimento de asas, e as restrições de espaço exigem a miniaturização dos controladores nervosos centrais para o voo7. Em 75% de todas as espécies de insetos voadores, músculos de vôo assíncronos, indiretos e altamente especializados formam um sistema oscilatório que gera frequências de batimento de asas de 100 a 1.000 Hz por ativação de estiramento recíproco de músculos antagônicos das asas para garantir a propulsão para frente em baixos números de Reynolds . Os motoneurônios de vôo (MNs) que inervam os músculos de vôo assíncronos disparam em frequências muito mais baixas, portanto não ativando os músculos ciclo a ciclo. No entanto, a produção de energia é regulada por uma rede CPG no sistema nervoso central que controla as frequências de disparo do MN para ajustar os níveis de cálcio mioplasmático que, por sua vez, regulam a frequência e amplitude do batimento das asas1. Embora o voo assíncrono tenha surgido independentemente de 7 a 10 vezes durante a evolução, nem os princípios da arquitetura CPG para gerar saída MN do sistema nervoso central miniaturizado de voadores assíncronos nem as consequências funcionais disso foram identificadas.
Para quantificar padrões de vôo assíncronos e decifrar a arquitetura CPG, usamos a saída de disparo dos cinco MNs identificados (MN1-5) que inervam o músculo depressor longitudinal dorsal da asa (DLM) do sistema de modelo genético Drosophila melanogaster, bem como outros espécies de insetos (para testar a generalidade). O DLM fornece a força para o movimento descendente da asa, consiste em seis fibras musculares, cada uma das quais é inervada por um dos cinco MNs identificados (MN1–5; Fig. 1a). Cada MN1-4 tem como alvo uma das quatro fibras DLM mais ventrais ipsilaterais ao seu somata, enquanto o MN5 inerva as fibras DLM 5 e 6 no lado contralateral ao soma MN5 (Fig. 1a). Esta arquitetura neuromuscular é conservada nas espécies de insetos examinadas (gafanhoto12, mariposa13, varejeira14).
a, Gravação representativa de MN1–5 e frequência de batimento de asas (traço inferior, ampliado na caixa preta) durante o vôo amarrado. Esquema codificado por cores de MN1–5 no VNC e projeções axonais para as seis fibras do DLM. b, As frequências médias de disparo de MN são semelhantes dentro de cada animal. O código de cores é o mesmo de a. n = 8 animais. Os dados são média ± dp c, frequência de disparo de MN e frequência de batimento de asas (WB) (as barras vermelhas indicam faixas de trabalho) estão linearmente relacionadas dentro de um animal (pontos cinza; coeficiente de correlação, r2 = 0,63; P < 0,0001, t- bicaudal teste) e com maior variância também entre animais (pontos vermelhos; n = 100; coeficiente de correlação, r2 = 0,31; P < 0,0001, teste t bicaudal). d, As respostas de disparo de MNs (traços superiores) a injeções de corrente de diferentes amplitudes (traços inferiores). e, A frequência média de resposta do MN (f) e a amplitude da corrente injetada (I) estão aproximadamente linearmente relacionadas para 2–30 Hz (n = 15 animais), excedendo, portanto, as frequências normais de disparo do MN observadas durante o vôo (inserção; ~ 3–12 Hz, dados de c). Os dados são média ± sem (gráfico principal) e mediana ± intervalo (inserção). f, Durante o vôo, os picos MN1–4 são dispersos no tempo (no estado de expansão) com sequências características. Cada animal alterna entre diferentes estados de expansão durante o voo, mas os mesmos estados de expansão são preferidos entre os indivíduos (n = 8). Os box plots mostram a mediana (linha central), quartis (limites da caixa) e intervalo (barras de erro). g, Tempo de picos de MN1–4 em quatro estados de exibição subsequentes (1423 (vermelho); 1243 (turquesa); 1234 (verde); 1324 (azul escuro)) durante o vôo.
UAS-shakB-RNAi, middle) and overexpression of ShakB in MN1–5 (bottom). The black arrows mark MN4 and MN5 spikes, and the red arrows indicate simultaneous MN4–MN5 spikes. b, Phase histograms of the occurrence of MN5 spikes (y axis) in relation to consecutive MN4 spikes (phase φ = 0 corresponds to the MN4 spike) for control (top), shakB KD (middle) and ShakB overexpression (bottom) with a magnified view (inset) (n = 10 animals for each genotype). Data are mean (coloured bars) ± s.e.m. (grey). c, MN1–5 dye coupling in the dfmr1 RNAi KD background to increase dye uptake28. Scale bar, 20 μm. d–h, Intracellular recordings of MN pairs. d, Hyperpolarizations and depolarizations were conducted bidirectionally (from cell 1 to cell 2 and vice versa). e, Increasing current injection amplitude (top trace) increases response amplitudes in electrically coupled MNs (bottom trace). f, Plotting the mean presynaptic voltage (Vm) area against the mean postsynaptic voltage area (left) reveals linear relationships, but regression slopes differ between distinct MN pairs (5 animals with strong coupling between the MN1–MN2 and MN3–MN4 pairs; 10 animals with weak coupling between the MN1–MN3, MN1–MN4, MN2–MN3 and MN2–MN4 pairs). The mean CC (postsynaptic peak voltage divided by presynaptic peak voltage; right) differs significantly between MN1–MN2, MN3–MN4 (red, 6 pairs) and all other pairs (green, 10 pairs). Data are mean ± s.e.m. (left) and mean ± s.d. (right). g, RNAi KD of shakB eliminates detectable electrical coupling between MNs (3 animals). h, The CC for the spike AHP is higher than for the spike overshoot. i, Firing of a coupled MN ceases during the AHP of the presynaptic MN./p>0.21 yield network synchrony (splayness = 0; 200 simulations per CC, green dots; the black line shows the average). d, Quantification of 60 s simulations (green, 10 simulations per condition) with a weak CC (0.005) yields significantly lower MN4–MN5 synchronization indices (Methods; median = 0.54) compared with strong coupling (CC = 0.258; median = 1.0; two-sided Mann–Whitney U-test, P = 0.0002). Similarly, experimental (exp.; purple) synchronization indices are significantly lower in the controls (median = 0.56, 11 animals) compared with the ShakB-overexpression group (median = 0.84, 7 animals, P = 0.0008). e, Increasing Shab channel levels transforms the single-MN model dynamics from HOM near the SNL point through SNIC to Hopf types (Extended Data Fig. 9a), which vary in action potential waveform (top) and PRC (middle). Averaging theory (Methods and equation (4)) yields the odd part of the coupling function (bottom) for each phase distance ∆φ, of which the fixpoints (black dots) determine stable network states. Only the SNL type yields one stable fixpoint at phase 0.5, therefore favouring anti-phase firing. f–h, Shab overexpression in MN1–5 nearly doubles Shab current (f), which causes in-phase firing of the MN3–MN4 pair (g) and significantly (two-sided Mann–Whitney U-test, P = 0.0434) increased synchronization indices (median = 0.52, 10 animals) compared with the controls (median = 0.43, 8 animals) (h). Similarly, increasing Shab in models with weighted GJs (as in Fig. 3i) significantly increased MN3–MN4 synchronization (sync.) indices (median = 0.99, P = 0.0002). i,j, Network models with heterogenous CCs (i) as found in vivo (Fig. 2f) yield preferred splay states as in animals (j, right; 10 simulations per condition; 8 animals, the purple dots depict median values of in vivo data), whereas homogenous coupling does not (j, left). For the box plots in d, h and j, the median (centre line), quartiles (box limits) and range (whiskers) are shown./p>0.21, the network state is synchronized (Fig. 3c). To test these model predictions experimentally, we manipulated gap-junction strength genetically and quantified the synchrony of the MN4–MN5 pair from in vivo recordings during flight (Fig. 3d). In control animals with weak gap junctions, the synchronization index (Methods) is low, similar to model simulations with weak gap junctions. RNAi KD of electrical synapses increases synchronization in vivo (Fig. 3d), underscoring that gap junctions are required for desynchronization. Finally, the model predicts synchrony for strong electrical coupling. Indeed, strengthening of electrical coupling by ShakB overexpression significantly increases synchrony in vivo (Fig. 3d; see also Fig. 2b). Thus, weak electrical coupling is required for network desynchronization./p>5 GΩ; membrane potential of −70 mV was held with a holding current smaller than ±100 pA; series resistances of >15 MΩ were not accepted to ensure good control when applying current injections; only if these criteria were met for both MNs, the recordings were switched to current clamp mode. Resting membrane potential was around −60 mV without current injection. To determine coupling strength and rectification parameters of gap junctions between MNs, depolarizing and hyperpolarizing current was injected into one MN while the other was monitored simultaneously, and vice versa. Slow tonic firing was induced in one or both MNs at rates of between 3 and 8 Hz, as is observed during flight behaviour, by small somatic current injections while monitoring the respective other MN. For input–output relationships, firing was induced by 1,000 ms square pulse current injections up to 1 nA in 0.1 nA increments./p>2 electrically coupled neurons, this causes a frustrated state because antiphase locking at Δφ = 0.5 cannot be achieved for all units at the same time. In a small network, such as the MN1–5 network with its five coupled neurons, the splay state represents a low-frustration solution that determines the most likely network state60./p> 2. However, this is not observed in the CPG recordings (Fig. 1a). For the network to show frustration, pairs of neurons must be phase-repellent./p>3.0.CO;2-S" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-9861%2820000619%29422%3A1%3C1%3A%3AAID-CNE1%3E3.0.CO%3B2-S" aria-label="Article reference 13" data-doi="10.1002/(SICI)1096-9861(20000619)422:13.0.CO;2-S"Article CAS PubMed Google Scholar /p> P{UAS-GFP.VALIUM10}attP2), ShakB RNAi-kd (GMR23H06-ADZ attP49;GMR30A07-DBD attP2 > P{TRiP.HMC04895}attP2)). For the experimental data, a two-sided Pearson correlation determined a strong negative correlation (r = −0.94, p < 0.0001, n = 10). (e,f) Firing phase relationships between MN4 and MN5 in control animals (see also Fig. 2a,b, Extended Data Fig. 1) remain similar upon UAS-RNAi knockdown of receptors for inhibitory chemical synapses in MN1–5 (under the control of DLM-MN spilt-GAL4, GMR23H06-ADZ attP49; GMR30A07-DBD attP2), (e) the glutamate gated chloride channel (GluCl) and (f) Rdl GABA-ARs. GluCl-RNAi knockdown efficacy was confirmed by Western blotting and Rdl GABA-AR knockdown efficacy has previously been confirmed64. Coloured bars represent the average values from 10 animals for GluCl-RNAi, 8 animals for Rdl GABA-AR-RNAi, and grey bars the s.e.m./p>
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